细胞内一氧化氮荧光探针(DAF-FM DA溶液)

产品货号：

KM0149

中文名称：

细胞内一氧化氮荧光探针(DAF-FM DA溶液)

英文名称：

DAF-FM diacetate

产品规格：

100T

发货周期：

1～3天

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本产品以溶于DMSO的储存液形式提供，浓度为5mM。使用简单，只需用合适的生理缓冲液或培养基稀释到相应的工作浓度即可。建议起始工作浓度范围是1～10μM。适合细胞内NO的检测，可以进行实时检测。若收集细胞后再装载探针，通常至少能检测100个样品。

DAF-FM DA是新一代用于检测和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的荧光探针。具有细胞膜渗透性，无荧光。一旦进入细胞后，被细胞内的酯酶催化形成不具有膜渗透性的DAF-FM。DAF-FM本身仅有弱荧光，但和NO反应后可产生强烈荧光，最大激发波长为495nm，最大发射波长为515nm（作用机理见下图）。任何可以检测荧光素的仪器都能检测，包括流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标板和荧光计。

DAF-FM DA是一种细胞膜渗透性的一氧化氮（NO）荧光探针，Ex/Em=495/515nm。DAF-FM DA主动扩散穿透细胞膜，一旦进入细胞，胞内酯酶使其去乙酰化生成DAF-FM。DAF-FM本身荧光很弱，其荧光量子产率~0.005，但与NO反应后荧光增强约160倍，光量子达到~0.81。与最早的NO探针DAF-2相比，DAF-FM具有以下几个优势：

DAF-FM与NO形成的加合物的光谱不依赖pH（＞5.5）；
DAF-FM与NO形成的加合物的光稳定性明显强于DAF-2/NO加合物；
DAF-FM的NO检测下限~3nM，比DAF-2灵敏度高（~5nM）。

CAS号：254109-22-3
分子式：C₂₅H₁₈F₂N₂O₇
分子量：496.42
纯度：≥98%(HPLC)
外观：淡黄色溶液
Ex/Em：~495/515nm(DAF-FM)
保存：-20℃避光干燥保存，1年有效。

注意事项

DAF-FM DA在4℃、冰浴等较低温度下会凝固而粘附在离心管管底、管壁或管盖内，可在25℃温育片刻直至完全溶解后再使用。
第一次使用本品，请置于室温或25℃温育片刻直至完全溶解后，低速离心后，根据单次用量分成小包装后-20℃避光干燥保存，避免反复冻融。
BSA和酚红对DAF-FM的荧光检测有干扰，请避免体系内含有这些组分。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、工作液制备
取适量的母液用适当的生理缓冲液（比如PBS，HBSS）或新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释到工作浓度，比如取5μlDAF-FM DA(5mM)按照1:1000的比例稀释到5mlDAF-FM DA(5μM)工作液，充分混匀。
注意：工作液必须现配现用，实验结束后需丢弃多余探针。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，为此，请尽快用完。
注意：探针的最佳工作浓度需根据自身的细胞类型或实验条件来摸索，或参考文献。一般情况下，在保证获得足量荧光信号的前提下，尽量选择最小浓度的探针，这样可尽量减少酯的水解副产物如甲醛和乙酸的富集。

二、探针装载
对于刺激时间较短（通常为2h以内）的细胞，先装载探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6h以上）的细胞，先用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

探针原位装载（仅适用于贴壁细胞）
- 去除细胞培养液，加入适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入工作液体积为1mL。
- 37℃孵育20min。
- 用PBS,pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。
收集细胞后探针装载
- 细胞收集后，用适当体积准备好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀释后的工作液）重悬细胞，使得细胞浓度为一百万至二千万/毫升。
- 37℃孵育20min。以上操作可以在离心管内进行。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。c）用PBS,pH7.4洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。
- 直接用适当的阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后再刺激细胞。

三、荧光检测

对于原位装载探针的样品：可以用激光共聚焦显微镜直接观察（用普通的荧光显微镜观察效果相对较差），或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品：可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
参数设置：使用495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。DAF-FM-NO反应产物的荧光光谱和荧光素非常相似，可以用检测荧光素的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以。

四、其他说明

上述步骤推荐DAF-FM DA的工作浓度为5μM。对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000的比例稀释DAF-FM DA，使装载探针时DAF-FM DA的工作浓度为1～2.5μM。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把DAF-FM DA的工作浓度为调整为10μM，以提高检测的灵敏度。
探针装载的时间可以根据情况在15～60min内适当进行调整。

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